激光荧光共聚焦显微镜的应用

激光荧光共聚焦显微镜是在荧光显微镜的基础上加装激光扫描装置，可以利用可见光对荧光探针进行激发，再利用计算机图像处理技术获得细胞的图像。激光荧光共聚焦显微镜不仅可以观察固定的细胞、组织切片，还可以对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态观察和检测。

一.Z-STACK 三维构建

激光荧光共聚焦显微镜采用的是类似于连续断层扫描的方法，即通过移动Z轴获得一张张连续的光学切片，通过计算机可以将这些光学切片重新组构建成一张三维图像（可做单色或多色图像处理组合成细胞真实的三维结构）。通过旋转，可观察细胞各个侧面的表面形态，也可以从断面观察细胞的内部结构，测量细胞的长宽高，体积，细胞数量统计等功能。通过shadow功能，可以去除细胞上的阴影，突出细胞的立体效果。LSCM的Z-STACK广泛应用于细胞骨架，细胞凋亡，细胞器等的细胞结构分析中。

二. 细胞静态结构检测，原位鉴定细胞或组织内生物大分子观察

1.检测细胞凋亡

2.细胞原位检测核酸

细胞核定位及其形态学观察，检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察

3.细胞器观察及测定

4.观察细胞骨架结构

5.检测细胞内脂肪

6.检测细胞融合

三.动态观察

1.实时定量测定细胞内钙的变化

2.测定细胞内PH的变化

激光共聚焦显微镜是测量若干种离子浓度并显示其分布的有效工具，对焦点信息的有效辨别使在亚细胞水平显示离子分布成为可能。利用荧光探针，可测量单个细胞内PH和多种离子（Ca+，K+，Na+，Mg2+）在活细胞内的浓度及变化。一般来说，电生理记录装置加摄像技术可以快速检测细胞内离子量变化，激光共聚焦技术可以提供更好的亚细胞结构中Ca+浓度的动态变化图像，对研究Ca+细胞内动力学有意义。

3.检测膜电位的变化

JC-1 低电位下单体存在，发绿色的荧光，高电位下J-聚集体发红色的荧光，随电位增加，红色荧光也增加。

4.检测细胞内活性氧物种的产生

5.药物筛选

对药物，病毒，细菌等进行荧光标记，当检测药物跨膜进入组织或细胞中时，可检测药物是否进入，位置含量以及动态过程。

6.细胞间的通讯研究

激光共聚焦显微镜可通过观察细胞缝隙连接分子的转移来测量传递细胞调控信息的一些离子，小分子物质。该技术可以用于研究胚胎发育，生殖发育，神经生物学，肿瘤发生等过程中缝隙连接通讯的基本机制和作用，也可以用于鉴别对缝隙连接作用有潜在毒性的化学物质。

7.观察细胞迁移和生长

LSCM已经极大地提高了光子产生效率，样品可以与更小毒性的染料结合减少每次扫描时激光束对细胞的损伤，可用于数小时的长时程定时扫描，记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。

8.检测荧光漂白的恢复

当一个细胞内的荧光分子被激光漂白或淬灭失去发光能力，临近细胞中未被淬灭的荧光分子可以通过细胞间的缝隙扩散到已经被漂白的细胞中，从而恢复荧光。该技术可用于分析分析细胞内蛋白质运输，受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。