荧光共聚焦显微镜的成像原理是怎样的？

　　荧光共聚焦显微镜系统主要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机和图像输出设备。那么你知道它的成像原理是怎样的吗？

　　

　　荧光共聚焦显微镜用一个点光源来照射标本，在焦平面上形成一个小的、定义明确的光斑。该光斑照射后发出的荧光由物镜收集，并沿原照射光路送回由双向色镜组成的分光器。分光器将荧光直接送到检测器。在光源和检测器前面都有一个针孔，分别称为照明针孔和检测针孔。两者的几何尺寸相同，约为100-200纳米；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，也就是说，光点可以通过一系列透镜同时聚焦于照明针孔和检测针孔。这样，来自焦平面的光可以集中在检测孔的范围内，而来自焦平面上方或下方的散射光则被阻挡在检测孔之外，无法成像。激光对样品进行逐点扫描，检测针孔后的光电倍增管也逐点获得相应光点的共焦图像，转换为数字信号传输给计算机，最后在屏幕上汇集成整个焦平面的清晰共焦图像。
 

　　

　　每个焦平面图像实际上是标本的一个光学截面，它总是有一定的厚度，也被称为光学切片。由于焦点处的光强度远远大于非焦点处的光强度，而非焦点面的光被针孔过滤，所以共焦系统的景深近似为零。沿着Z轴方向扫描可以实现光学断层扫描，在待观察样品的焦点处形成一个二维的光学切片。将X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过积累连续层的二维图像，用专门的计算机软件进行处理，就可以得到样品的三维图像。即检测针孔和光源针孔始终聚焦在同一点上，使聚焦面以外的激发荧光不能进入检测针孔。

　　

　　荧光共聚焦显微镜的工作原理可以简单表述为：以激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上增加激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制进行数字图像采集和处理的系统。